Учился в церковноприходской школе, затем в гимназии. Брать уроки живописи начал в Астрахани у Павла Власова, художника, педагога, выпускника Петербургской Академии художеств.
В 1896 году Кустодиев поступил в Петербургскую Академию художеств. Обучался сначала в мастерской Василия Савинского, со второго курса — у Ильи Репина, участвовал в работе над его картиной «Заседание Государственного совета» (19011903).
В 1903 году Кустодиев окончил Академию художеств. Его дипломная картина «Базар в деревне» была удостоена золотой медали, дававшей право на пенсионерскую поездку за границу и по России.
Борис Кустодиев выбрал Париж. В столице Франции художник успел присмотреться к европейской живописи и использовать свои впечатления в прекрасной картине «Утро» (1904), но менее чем через полгода вернулся в Россию, соскучившись по родине.
После возвращения Кустодиев пробовал силы в книжной графике, в частности, проиллюстрировав «Шинель» Николая Гоголя (1905), а также в карикатуре, сотрудничая в сатирических журналах периода первой русской революции.
На революцию 1905 года Борис Кустодиев отреагировал серией аллегорических рисунков, отражающих остроту исторического момента. Но главным делом для него продолжала оставаться живопись. Он исполнил ряд портретов, среди которых выделялся «Портрет Р. И. Нотгафт» (1909), а также «Портрет священника и дьякона» (1907) и «Монахиня» (1908).
Одновременно с этим он работал над картинами, посвященными изображению старой русской жизни, преимущественно провинциальной. Материал для них художник черпал из воспоминаний детства и впечатлений от частого пребывания в Заволжье, в Кинешемском уезде, где в 1905 году построил доммастерскую. Он разворачивал увлекательные рассказы, полные занимательных подробностей, в многофигурных композициях серии «Ярмарки» (1906, 1908), «Деревенский праздник» (1910) и воссоздавал характерные русские женские типы в картинах «Купчиха», «Девушка на Волге», «Красавица» (все три 1915), окрашенных восхищением и мягкой авторской иронией.
В январе 1909 года Кустодиев был избран членом комитета «Союза русских художников», а в октябре того же года предпринял путешествие по Австрии, Италии, Франции и Германии. 26 октября 1909 года по представлению Ильи Репина и Архипа Куинджи Кустодиев был избран членом Академии художеств.
В 1911 году Борис Кустодиев начал работать оформителем в театре, где он создал ряд прекрасных декораций. Особенно впечатляющими были его декорации и эскизы костюмов к пьесам Александра Островского.
Однако вскоре Кустодиеву пришлось отправиться на лечение в Швейцарию в связи с тяжелым заболеванием спинного мозга. Лечение не помогло, и художник вернулся в Россию. Болезнь прогрессировала. В 1916 году наступил полный паралич ног. Несмотря на это, Кустодиев продолжал работать над новыми полотнами. Прикованный к креслукаталке и мучимый частыми болями, Кустодиев создал картину «Масленица» (1916) идиллическую, наполненную радостью панораму праздника в русском провинциальном городе.
С начала 1900х годов Кустодиев разрабатывал жанр портретакартины, связывая модель с интерьером или пейзажем. Наряду с внешне эффектными, часто салонными портретами он создавал портреты интимнолирического склада, а также сходные по общей концепции и манере исполнения с его бытовым жанром, в которых портретируемый, сохраняя свою индивидуальность, приобретает обобщенные национальные черты (портреты Александра Анисимова и Федора Шаляпина).
После революции 1917 года Борис Кустодиев трудился над произведениями на новые для него темы. Он создавал рисунки для календарей, иллюстрации к книгам, эскизы оформления улиц, занимался изготовлением марок, дизайном почтовой бумаги, пропагандистскими плакатами.
Последнее десятилетие его жизни оказалось необычайно продуктивным. Он написал две большие картины с изображением праздника в честь открытия II Конгресса Коминтерна, исполнил множество графических и живописных портретов, делал эскизы праздничного оформления Петрограда, рисунки и обложки для книг и журналов разного содержания, изготовлял настенные картинки и календарные «стенки», оформил 11 театральных спектаклей. Кустодиев выполнил литографские иллюстрации к сборнику «Шесть стихотворений Некрасова» (1922), рисунки к повестям Николая Лескова «Штопальщик» (1922) и «Леди Макбет Мценского уезда» (1923).
За год до кончины Кустодиев завершил картину «Русская Венера», а последним произведением художника был этюд триптиха «Радость труда и отдыха».
5 мая, после поездки в город Пушкин, у Кустодиева началось воспаление легких. Умер художник 26 мая 1927 года в Ленинграде (ныне СанктПетербург). Был похоронен на Тихвинском кладбище АлександроНевской лавры.
15 мая 2002 года в Астрахани в усадьбе МоисеевыхЗлобиных, являющейся образцом городской застройки конца XIXначала XX века, был открыт Доммузей Бориса Кустодиева. В фондах музея хранится 109 работ, в числе которых около 100 рисунков, скульптура, мемориальные предметы и документы, принадлежащие художнику и членам его семьи.
В феврале 2011 года картина «Купчиха» Бориса Кустодиева стала самым дорогим лотом торгов русским искусством лондонского аукциона MacDougall's. Полотно ушло с молотка за 1,8 миллиона фунтов стерлингов.
В ноябре 2012 года картина Бориса Кустодиева «Извозчик» из коллекции лауреата Нобелевской премии по физике Петра Капицы была продана на аукционе Christie's в Лондоне за 4,4 миллиона фунтов стерлингов, что стало мировым рекордом стоимости для работ русского художника.
Кустодиев был женат на Юлии Прошенской (18801942), они обвенчались в 1903 году. У них была дочь Ирина и сын Кирилл, которых художник часто изображал на своих картинах. Кирилл Кустодиев работал художникомдекоратором в ленинградских театрах, в том числе в Ленинградском академическом театре драмы (ныне Александринский театр), Театре оперы и балета имени С.М. Кирова (ныне Мариинский театр), умер в 1971 году. Ирина Кустодиева была актрисой, скончалась в 1981 году. Внучка художника Татьяна Кустодиева ведущий научный сотрудник Отдела западноевропейского изобразительного искусства Государственного Эрмитажа, хранитель итальянской живописи ХIIIXVI веков, кандидат искусствоведения.